图片痔疮 肛交
Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋一火是最常用的检测细胞凋一火的步伐之一。在细胞开动早期凋一火时， 磷脂腺丝氨酸会外翻到细胞名义，即细胞膜外侧。举例，用绿色荧光探针 YF488 标志的 Annexin V，它不错结合外翻的磷酯酰丝氨酸，从而检测细胞凋一火的蹙迫特征。碘化丙啶(Propidium Iodide， PI)是一种 DNA 结合染料，它不错染色坏死细胞或凋一火晚期丧失细胞膜完整性的细胞的细胞核。 PI 不错由 488，532 或 546 nm 的激光引发，呈现红色荧光。因此将 YF 488-Annexin V 与PI匹配使用，就可离别活细胞、旦夕期凋一火细胞和死细胞。
艳母下载图片
YF488 染料与传统 FITC 比拟，荧光亮度更高，且不受环境中 pH 的影响，具有精采的光踏实性。一、操作技艺（贴壁细胞为例）1.1 对照拂的开采
1）空缺管：熏陶凋一火的细胞不加染料，用来退换电压；
2）单染管：分别需要只加 PI 和荧光标志的 Annexin V 两个单染管，用来退换赔偿；
3）施行管：熏陶凋一火的细胞加本次施行的所有荧光染料；
4）阴性管：普通培养细胞加入染料，阐发细胞普通现象，摒除假阳性1.2 细胞解决及染色
1）取对数滋长期细胞接种于 6 孔板或 6cm 培养皿（用什么培养皿取决于所培养的细胞，保证最终网罗的细胞数大于 5×105 个）；
2）证据施行需要解决细胞。网罗细胞时将培养液吸至离心管内，PBS 洗涤细胞一次，用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，并网罗于离心管中（悬浮细胞可成功离心网罗）；注：用胰卵白酶消化然后使细胞在最好细胞培养要求和培养基中规复约 30 分钟，然后再染色。 胰卵白酶消化会暂时松弛质膜，允许Annexin V结合磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞质名义上，从而导致假阳性染色。
3）将网罗的培养基和细胞混匀，4℃ 300g 离心 5min，弃上清。用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次 4℃ 300g 离心 5min；
4）加入 1× Binding Buffer，将细胞退换成交流浓度（一般为 1×106/mL）；
5）取 1-2×105 个细胞悬液于流式管中，加入适量标志了荧光染料的 Annexin V 和适量 PI，轻轻混匀；
6）室温避光孵育 15-20 min；
7）加入 300 μl PBS 重悬细胞痔疮 肛交，尽快（1 小时内）用流式细胞仪检测。PS：对照拂开采尤其蹙迫
二、施行扫尾图
2.1 YF488-Annexin V 荧结义微镜施行恶果
图片
2.2 YF488 -Annexin V 流式施行恶果图
图片
YF 488-Annexin V 与 PI 双染试剂盒能够完竣的离别活细胞，早期凋一火细胞及晚期凋一火细胞/坏死细胞。
三、常见问题3.1 各象限代表的细胞现象问题
图片
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋一火细胞在其中，致使机械毁伤的细胞也包含其中。AnnexinV-/PI+越多，施行扫尾越不信得过，提议施行中尽量放胆这一象限细胞比例。Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋一火细胞。Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋一火细胞。Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。3.2 赔偿退换问题
1）不同的染料组合，做爱图片赔偿大小不同。
2）电压对赔偿的影响不小，电压变赔偿变，是以咱们要先退换FSC、SSC和荧光通说念的电压，电压调好之后再调赔偿。
图片
3）细胞亦然影响赔偿大小的一个身分，如淋巴细胞和肿瘤细胞之间、活细胞与固定后细胞之间，标志交流的荧光素偶联抗体，使用交流的通说念时，各通说念之间的赔偿可能不同。是以当细胞理化性质相反较大时，最好再行退换新的样品细胞的赔偿，确保获取准确的流式扫尾。3.3 对于假阳性问题
1）对贴壁细胞而言，消化是最重要的技艺，消化液需用不含 EDTA 的胰酶，因为 Annexin V 和 PS 的结合需要 Ca2+，而 EDTA 是 Ca2+ 螯合剂，使用含有 EDTA 的胰酶会变成假阴性。其次消化时候不宜过长，奏乐细胞要柔柔，因为胰酶的过度消化和机械毁伤齐会引起细胞膜的毁伤，变成假阳性。细胞消化下来后，提议在培养箱中在孵育 30min，使细胞膜规复完整性，幸免假阳性，或者将细胞报讯在含 2% BSA 的 PBS 中，谛视进一步的毁伤。
2）神经细胞膜容易松弛外翻，导致假阳性，是以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋一火不适用于神经细胞。3.4 对于荧光染料聘任的问题
1）对于荧光染料的聘任，提议要是流式细胞仪带有 488 nm 和 633 nm 两个或以上激光管，最初商量用 APC 或 YF647 标志 Annexin V，因为它和 PI 通说念确切毋庸商量光重复问题，不错减少退换赔偿的烦扰，要是只好 488 nm 激光管则可聘任YF488/FITC 标志的 Annexin V。2）再次需要商量细胞是否自带荧光，因为感染病毒或质粒转染的细胞常常带 GFP 荧光，GFP 与 YF488/FITC 通说念重复，不可聘任 YF488/FITC 标志的 Annexin V，此时要是只好 488 nm 一根激光管不错用 PE 标志 Annexin V，用 7-AAD 代替 PI，或者改用 YF647 Annexin V 代替 YF488。3）终末还要商量解决身分是否带有荧光，本施行室就遭受过一个促凋一炸药物 Doxorubicin 本人发红色荧光，对 PI 通说念的检测变成严重侵略，而且浓度越大侵略越显明。这时提议采取其他检测步伐。3.5 设门问题1）要非常谨防在FSC/SSC圈门时，所选细胞鸿沟会对扫尾变成较大影响，是以在分析数据时，要把所有细胞齐圈进FSC/SSC的门内，这么施行扫尾才会更信得过。如图，使细胞群八成位于对角线上，何况细胞群较市欢，群内细胞比例要在80%以上，要是细胞全部圈入，细胞比例才50%或者更低，暴露细胞被压在了坐标轴上，这时要再行退换FSC和SSC。图片
2）贴壁细胞作念Annexin V凋一火检测，粗鄙分群不太章程，这时咱们不错证据不加药细胞来画不章程的十字门。如底下图形的设门神气。图片
图片
3.6 免疫染色与凋一火染色规章问题Annexin V凋一火染色不错和抗体通盘对细胞进行染色吗？不错，但提议Annexin V和其它抗体分开染色。举例Annexin V、PI和CD3、CD8同期标志淋巴细胞，不错先在PBS中标志CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含钙离子）中标志Annexin V。3.7 其他问题1）液氮保存的组织块，不提议再作念流式细胞分析。因为流式细胞分析要求细胞散播、单个，活性好，组织在冻存、复温的经过中会有大宗的细胞圆寂，同期经过这照旧过的组织在分离成单个细胞的时候会形成好多细胞碎屑，不宜端淑式检测，是以用于流式检测的标本最好是崭新标本，即取材后立即检测，恶果最好。液氮保存的组织块，不错将组织标本进行切片，然后作念原位染色，不雅察组织细胞的凋一火。
2） Annexin V也不错用在植物和细菌中检测凋一火，具体施行技艺可参考推测文件。
3）要是样品起首于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，侵略施行扫尾。
4）操作中务必行动柔柔，离心后阐发管底是否有细胞，粗鄙有东说念主液体一甩，细胞也给甩走了。操作中还要谨防避光。
聚焦自噬崭新资讯 热心自噬科学前沿
本站仅提供存储工作，所有实质均由用户发布，如发现存害或侵权实质，请点击举报。